Светодиодное, люминесцентное освещение и поведенческая активность лабораторных животных.
Анализ результатов экспериментальных исследований

Актуальность

Приоритетным направлением в области энергосберегающего освещения является применение светодиодных источников, что связано с их преимуществами в эксплуатации [4,10]. В настоящее время среди искусственных источников света внимание исследователей привлекают энергоэффективные люминесцентные и светодиодные лампы, свет которых может оказывать воздействие на функции органов и систем [2, 9, 17]. Ранее было продемонстрировано, что при десинхронозе в условиях люминесцентного освещения регистрируются некоторые изменения этологического статуса животных [5, 6], однако интерес представляет именно сравнительный анализ влияния светодиодных и люминесцентных источников искусственного света [7]. Кроме того, интерес к проблеме поддерживается ростом и широким использованием светодиодных источников света взамен люминесцентных, что, в конечном итоге, и делает актуальным проведенное сравнительное исследование влияния света этих типов источников на поведенческую активность и когнитивную функцию [12]. Цель исследования — сравнить в эксперименте показатели этологического статуса лабораторных животных в условиях искусственного светодиодного и люминесцентного освещения.

Материалы и методы

Экспериментальные исследования проведены в условиях in vivo на нелинейных половозрелых морских свинках (самцах) массой (300±50) г из питомника лабораторных животных филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ, находящихся в стандартных условиях вивария, на типовом рационе в соответствии с нормами, утвержденными Приказом Минздрава СССР № 1179 от 10.10.1983 г., со свободным доступом к пище и воде. Представленные в данной статье манипуляции с экспериментальными животными выполнялись строго в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETSIN 123, 18 марта 1986 г.), включая приложение А от 15.06.2006, с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях, от 22.09.2010. Организация исследования одобрена этическим комитетом ГБОУ ВПО ЮУГМУ Минздрава России (протоколы № 9 от 09.11.2013 г., № 1 от 22.01.2016). Объектом исследования выбрана морская свинка, поскольку данное лабораторное животное, в отличие от других экспериментальных животных (крысы, мыши) [14], по образу жизни проявляет дневную активность, а световосприятие и цветовосприятие у морских свинок приближено к цветовой чувствительности человеческого глаза, что также делает их адекватным объектом для изучения свет-ассоциированных измененных состояний макроорганизма [13, 14, 15, 16].

В исследовании использованы люминесцентные и светодиодные источники с одинаковым индексом цветопередачи Ra = 75, нейтрально-белым оттенком, с коррелированной цветовой температурой ССТ = 4500 К, коэффициентом пульсации светового потока у светодиодных ламп менее 4%, у люминесцентных — менее 5%. Уровень освещенности при использовании светодиодных ламп составлял 400 лк, люминесцентных — 420 лк. Светодиодные источники освещения: «ISAlight–Офис 32» ООО «Инженерные Системы Автоматизации» (Россия); люминесцентные источники: «LLAlight–Офис 30» той же компании. При проведении эксперимента искусственные источники света располагались на расстоянии 250 см над клетками с животными таким образом, чтобы световой поток равномерно распределялся по периметру клетки. Естественная освещенность в помещении на уровне клеток менялась в течение суток в соответствии с сезоном (август–сентябрь) и особенностями годовой фотопериодичности Южного Урала: в утренние часы (8–9 ч) — 50–200 лк, днем (10–16 ч) — до 800 лк в ясный день и 500 лк в пасмурный день, к вечеру (18–20 часов) — 150–300 лк. Продолжительность светового дня составляла 12–14 ч. Все лабораторные животные были случайным образом разделены на группы: группа 1 (n = 8) — животные в условиях естественного освещения (ЕО, 12 ч свет/12 ч темнота); группа 2 (n = 20) — животные в условиях стандартного фиксированного освещения (12 ч свет/12 ч темнота), создаваемого люминесцентными лампами (СФЛО); группа 3 (n = 18) — животные в условиях стандартного фиксированного освещения, создаваемого светодиодными лампами (СФСДО). Продолжительность эксперимента составила 30 суток. Оценку показателей в условиях ЕО, СФЛО, СФСДО осуществляли на 10-е, 20-е, 30-е сутки эксперимента.

Животным всех групп проведено исследование этологического статуса с использованием актографа «открытое поле» и водного «лабиринта» Морриса.

Тест «открытое поле» проводится с целью изучения поведения экспериментальных животных в новых (стрессогенных) условиях и позволяет оценить по выраженности и динамике отдельных поведенческих элементов, во-первых, уровень эмоционально-поведенческой реактивности животного, во-вторых, стратегию ориентировочно-исследовательского поведения [3,8]. Актограф представляет собой открытую квадратную площадку 80×80 см, ограниченную по периметру непрозрачными бортами. Дно арены разделено на 16 квадратов, в центре каждого квадрата имеется одно отверстие диаметром 3 см, предназначенное для выявления видоспецифического компонента исследовательской активности у грызунов (норковый рефлекс). Исследуемое животное помещали в открытое поле в угловой квадрат у стенки арены. Тест продолжался 30 мин. Каждое животное тестировалось один раз. В ходе теста регистрировали последовательности поведенческих актов: горизонтальную активность (ГА) — число пересеченных квадратов на дне арены; вертикальную активность (ВА) — число стоек животным на задние лапы с опорой и без опоры на борт арены; исследовательскую активность (ИА) — число заглядываний в отверстия в полу арены; число актов груминга (ГР); количество фекальных болюсов (ФБ). Поведенческие акты и вегетативные реакции регистрировали с помощью цифровой видеокамеры Logitech HD C525 (Китай). Полученные данные обрабатывали математически с использованием компьютерной программы Real Timer (ООО «НПК Открытая Наука», Россия). Тест проводили на 9-е, 19-е, 29-е сутки эксперимента.

Водный «лабиринт» Морриса применяется для исследования у животных состояния когнитивной функции, способности к пространственной навигации [1]. Представляет собой бассейн диаметром 180 см и высотой 60 см, заполненный водой. Воду в бассейне окрашивали молоком для исключения возможности визуально распознавать подводную платформу. Температура воды составляла (24±2) °С. На стенах бассейна закрепляли изображения черно-белых геометрических фигур для облегчения ориентирования животных в пространстве (круг, квадрат, треугольник, ромб). Платформу из полупрозрачного оргстекла 15×15 см помещали в центр северного сектора бассейна (рядом с фигурой ромба), ниже уровня воды на 1–2 см. Проводили ряд тестов: тест со скрытой платформой, тест на зрительное восприятие, тест без платформы. Движения животных фиксировали с помощью видеокамеры Logitech HD C525 (Китай), размещенной над бассейном. В ходе эксперимента выполнено три серии тестов в водном «лабиринте» Морриса: с 4-х по 9-е сутки эксперимента, с 14-х по 19-е сутки эксперимента, с 24-х по 29-е сутки эксперимента. В каждой серии тестов участвовали разные животные.

В тесте со скрытой платформой ежедневно в течение четырех дней животным давали по две попытки для поиска невидимой с поверхности воды платформы, для чего морскую свинку помещали в воду мордой к стенке в одном из четырех секторов бассейна. Попытка заканчивалась в момент нахождения животным платформы или через 90 с, если морская свинка не находила платформу. Отдых животного на платформе, независимо от результата теста, продолжался 30 с. Если животное оставалось на платформе менее 15 с, его возвращали на платформу дважды. В интервале между двумя испытаниями животные помещались в клетку на 5 мин. В водном «лабиринте» Морриса в тесте со скрытой платформой регистрировали среднее время поиска скрытой под водой платформы и среднюю длину траектории достижения скрытой под водой платформы между двумя попытками. В тесте на зрительное восприятие регистрировали время нахождения платформы, в тесте без платформы — время пребывания животного в каждом секторе, процент нахождения животного в области расположения подводной платформы. Видеокамера непрерывно снимала поведение с первой секунды проведения эксперимента до 30-й минуты, в том числе в течение первых 5 мин. Поэтому все акты поведения животных за первые 5 мин вошли в обработку данных и повлияли на результативность. По нашему мнению, увеличение времени фиксации поведенческих актов повысило информативность полученных данных. Полученные данные обрабатывали с использованием компьютерных программ Real Timer (ООО «НПК Открытая Наука», Россия) и Any-maze (Stoelting Co., США).

Характеристика выборок представлена в формате «М±m», где М — среднее арифметическое значение признака, m — стандартная ошибка среднего. Для анализа нормальности распределения применяли критерий Шапиро — Уилка, для проверки гипотез о равенстве генеральных дисперсий — критерий Левена. Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна — Уитни (U), Вальда — Вольфовитца (WW). Отличия считали значимыми при р≤0,05, а при р>0,05 принимали гипотезу о незначимости статистических различий.

Результаты и обсуждение

В тесте «открытое поле» в условиях люминесцентного освещения, по сравнению с естественным, отмечено: повышение ГА на 10-е и на 30-е сутки наблюдений; повышение ВА — на 10-е сутки; снижение количества актов ГР — на 20-е сутки эксперимента; снижение количества ФБ — на 30-е сутки.

Повышение ГА и ВА на 10-е сутки отражает исследовательскую составляющую поведения, что может свидетельствовать об активном ориентировочно-исследовательском поведении и отсутствии чувства тревоги у животных. Снижение ГР 20-е сутки интерпретируется только в сочетании с изменением других показателей. Учитывая, что остальные параметры достоверно не отличались от показателей группы, находящейся под воздействием ЕО, авторами было сделано заключение о том, что у животных отсутствуют признаки тревоги и ориентировочно-исследовательское поведение не страдает. Повышение на 30-е сутки ГА в сочетании со снижением количества ФБ, отражающих вегетативную реакцию животного, указывает на отсутствие у животных признаков тревоги и угнетения ориентировочно-исследовательского поведения (табл. 1).

Примечание: * — значимые (р<0,05) различия с группой ЕО.

В условиях СФСДО, по сравнению с ЕО, в тесте «открытое поле» установлено, что ГА и ВА повышаются на 10-е, 20-е и 30-е сутки наблюдения, ИА повышается на 20-е сутки, а количество актов ГР снижается на 20-е сутки эксперимента (табл. 2). Повышение на 10-е и 20-е сутки ГА и ВА, а также повышение на 20-е сутки ИА отражает активное ориентировочно-исследовательское поведение животных. Снижение количества актов ГР на фоне высоких показателей ГА и ВА на 30-й день исследования напрямую указывает на отсутствие признаков тревоги и угнетения ориентировочно-исследовательского поведения у исследуемых животных.

Примечание: * — значимые (р<0,05) различия с группой ЕО.

При стандартном фиксированном люминесцентном освещении в тесте со скрытой платформой водного «лабиринта» Морриса авторами данного исследования было зарегистрировано уменьшение времени поиска платформы на 30-е сутки проведения исследования (табл. 3, 4).

Примечание: * — значимые (р<0,05) различия с группой ЕО.

При проведении теста на зрительное восприятие у лабораторных животных отмечено уменьшение времени нахождения видимой платформы на 20-е и 30-е сутки эксперимента (рис. 1).

Рис. 1. Время нахождения лабораторными животными видимой платформы, [c], в тесте на зрительное восприятие в условиях светодиодного освещения.
Примечание: * — значимые (р<0,05) различия с группой ЕО

В тесте без платформы не обнаружено отличий в доле времени нахождения животного в области расположения подводной платформы в течение всего времени проведения эксперимента (табл. 5).

Анализ результатов исследования показал, что в ряде тестов водного «лабиринта» Морриса в условиях СФЛО отмечено улучшение ориентации лабораторных животных в пространстве на 20-е и 30-е сутки при отсутствии признаков снижения способности к обучению и долговременной памяти во все сроки проведения эксперимента.

При изучении когнитивной функции лабораторных животных в условиях СФСДО в тесте со скрытой платформой водного «лабиринта» Морриса время поиска платформы на 10-е и 20-е сутки не отличалось от показателей животных из группы ЕО (табл. 6).

Примечание: * — значимые (р<0,05) различия с группой ЕО.

При исследовании длины траектории поиска скрытой платформы авторами статьи не было обнаружено достоверных отличий от показателей группы ЕО на 10-е, 20-е и 30-е сутки во все дни проведения данного исследования (табл. 7).

При тестировании лабораторных животных на зрительное восприятие время нахождения видимой платформы достоверно уменьшалось по сравнению с показателями животных из группы ЕО на 10-е, 20-е и 30-е сутки проведения исследования (рис. 2).

Рис. 2. Время нахождения лабораторными животными видимой платформы в тесте на зрительное восприятие в условиях светодиодного освещения.
Примечание. * – значимые (р<0,05) различия с группой ЕО

* * *

Результаты исследования позволили сформулировать следующее: при сравнительном анализе этологического статуса животных в условиях искусственного освещения показатели, отражающие ориентацию в пространстве по наружным ориентирам, при светодиодном освещении повышаются в более ранние сроки, чем при люминесцентном, а именно — на 10-е сутки. Причем статистическая разница выявленных различий недостоверна. Возможным объяснением полученных результатов авторы считают то, что искусственные источники создают постоянный уровень освещенности объекта и угол падения света на объект, и это позволяет лабораторным животным воспринимать объекты с меньшей погрешностью в размерах, форме и цвете, способствуя их лучшему запоминанию данных объектов [11, 13].

Таким образом, можно сделать следующие выводы:

• В условиях стандартного фиксированного люминесцентного и светодиодного освещения, по сравнению с естественным, у исследуемых лабораторных животных не обнаружено признаков тревоги, угнетения ориентировочно-исследовательского поведения, признаков снижения способности к обучению и долговременной памяти, кроме того, отмечено улучшение ориентации в пространстве.

При сравнительном анализе этологического статуса у исследуемых лабораторных животных в условиях искусственного освещения отмечено, что ориентация в пространстве по наружным ориентирам при СФСДО статистически не отличается от показателей этологического статуса исследуемых лабораторных животных при СФЛО.